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「多多赢平台」《自然》重磅:CRISPR大飞跃!适用范围扩大四倍,特异性提升百倍!|奇点猛科技

2020-01-11 18:57:13      访问量:701

「多多赢平台」《自然》重磅:CRISPR大飞跃!适用范围扩大四倍,特异性提升百倍!|奇点猛科技

多多赢平台,本周的《自然》有篇神奇的文章,点进去一看版都没排就发布了。再仔细看,从接收到在线发表,也就用了一个月!看看内容,其实对为啥这么着急发布也不难理解。毕竟炙手可热的crispr获得了一个质的飞跃,这么重磅的消息,换谁谁不急啊!

这篇文章来自博德研究所(broad insititude)的大牛david liu。这位在crispr领域颇有建树的年轻科学家,此次为我们带来了全新的进化版cas酶——xcas9[1],比起目前使用最广泛的spcas9,xcas9在转录激活、dna剪切、单碱基编辑等方面的应用范围扩大了四倍!这意味着,利用crispr-cas9对目前已知致病突变修改的可能,从原来的不到三成猛涨到七成以上!与此同时,令研究者喜出望外的是,xcas9的脱靶效应比spcas9低得多得多,部分序列的试验数据仅有原始版的1/100!

这是我们认知范围里,能够应用在哺乳动物细胞中的、适用范围最广泛的cas9变体,也是首次实现了适用范围、dna特异性、剪切活性的全面提升。

刘大卫老师!迷妹呼唤你赶紧拍新宣传照!起码要赶上刷nature的频率啊!

要想说清楚xcas9为啥这么厉害,还得从cas酶的限制说起。

大家都知道,crispr/cas系统原本是原核生物为了应付外源遗传物质入侵的一种防卫机制,所谓的crispr序列,就是敌人的“黑名单”。每当有一个新的敌人入侵,crispr/cas系统就会剪下它的一段基因作为“身份证”,插入crispr序列中保存起来,以备下一次敌袭。我们科学家也正是利用crispr/cas系统的这个特点来实现对目标基因的剪切和替换。

但是啊,这段剪下来的“身份证”可不是随意选择的,它们的附近往往具有一段特殊的序列,我们把它叫做原间隔序列临近基序(pam)。这段序列根据cas酶的种类不同而有所不同,像现在科学家最常使用、最成熟的spcas9,主要识别的就是ngg序列(n指任意碱基)。spcas9也是目前pam适用最广泛的cas酶。

这个最广泛有多广泛?我们简单计算一下,dna存在四种碱基,ngg出现的可能性只有十六分之一!对于沉默特定基因来说,这个范围差不多够用了,但是近年来,单碱基编辑技术不断走向成熟,这项技术要求pam位于目标碱基的15±2个核苷酸范围内[2,3],spcas9显然不能满足研究者的需求。而且如果能够进一步把pam适应范围扩大,让其落在dna同源重组位点附近,重组效率也能够获得一定的提升[4,5]。

想要改变cas酶的功能就要改变蛋白的结构。传统实验室方法是在蛋白的编码序列中人为制造突变,再进行功能筛查。但是想一想,这效率也太低了,一个个合成再筛选得筛到哪年去,累死科学家啊。

david liu不怕,他有个独门杀器,噬菌体辅助持续进化器(pace)[6]!简单来说,就是把需要突变的蛋白基因序列放进噬菌体基因组,利用噬菌体生命周期短暂的特点,进行大批量持续性的突变。噬菌体所寄宿的大肠杆菌内含有诱导突变的质粒,能够加速突变的发生。噬菌体最短十分种就能传代一次,一周内就能够实现成百上千次的传代变异,还完全不用科学家插手,比传统方法效率提高了100倍。

在编码的时候,把cas酶编码成噬菌体存活的必需基因,这样就可以利用其生命周期自动筛选掉没有表达的噬菌体了

利用这个独门杀器,研究者们很快筛选出了一批pam适用更广泛的cas酶——xcas9,其中xcas9(3.7)效果最好,xcas9(3.6)次之。

研究者决定对xcas9的真本事在人细胞中做一下测试。在激活转录这一点上,可以说xcas9(3.7)简直完胜,针对各pam效率比spcas9高出数倍不止;切割dna的能力,xcas9也完全没在怕的,spcas9的老强项ngg上已经赢过一头,对spcas9无能为力的ng、gaa、gat上均表现出了不俗的能力。这意味着,如果使用xcas9,crispr/cas系统的适用范围至少扩大了四倍!

转录激活上xcas9(绿)完胜

dna切割能力上xcas9也明显更胜一筹

这个扩大的pam范围拿到单碱基编辑上,则更令科学家们振奋了,毕竟目前为止,单碱基编辑器还只限于ngg这一段pam,能够进行修改的序列很有限。xcas9到手,单碱基编辑的适用范围也大大增加。

根据clinvar数据库[9]显示,能够利用c•g→t•a修正的致病突变共有4422个,原本单碱基编辑的适用范围只有26%,xcas9使这个数字跃升到73%!同样,能够利用a•t→g•c修正的致病突变有14969个,修正可能从28%跃升到71%!

单碱基编辑的适用范围也大大增加

pam适用范围扩大了这么多,crispr原本就是个问题的脱靶效应想必更严重了吧。。。然而并没有!研究者在对常见的几条基因序列进行了模拟,发现xcas9(3.7)的脱靶效应竟然远低于spcas9!在emx1序列中,spcas9的脱靶效应接近百分之二十,xcas9(3.7)居然百分之百“命中红心”;hek site4和vegfa这样有名的复杂基因,xcas9(3.7)命中率也有4-9倍的提升,真是厉害了!

xcas9的脱靶效应超乎意料的低

100%!!!

遗憾的是,xcas9为什么实现更广泛pam 的同时,脱靶效应还低了,这个问题并没有得到解决,david liu面对采访坦然回答“不知道”。

liu在采访中指出,spcas9经过多年的实验验证,但xcas9只经过几十个位点的测试,并不能百分百肯定xcas9就比spcas9更好(他谦虚了)。但不可否认的是,这种双赢的局面十分惊人,已经有科学家表示想要赶快在自己的实验室中使用xcas9。

话说pace这项技术也实在是很厉害,赶快拿来改造下其他的cas酶,估计还有大发现!

编辑神叨叨

学霸简直帅气逼人!此文自引率真是高!!nature是你家实验记录本吗!!!

参考资料:

[1] https://www.nature.com/articles/nature26155

[2] komor, a. c., kim, y. b., packer, m. s., zuris, j. a. & liu, d. r. programm editing of a target base in genomic dna without double-stranded dna cleavage. nature 533, 420–424, doi:10.1038/nature17946 (2016)

[3] gaudelli, n. m. et al. programmable base editing of a*t to g*c in genomic dna without dna cleavage. nature 551, 464–471, doi:10.1038/nature24644(2017)

[4] findlay, g. m., boyle, e. a., hause, r. j., klein, j. c. & shendure, j. saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair. nature 513,120–123, doi:10.1038/nature13695 (2014)

[5] yang, l. et al. optimization of scarless human stem cell genome editing.nucleic acids res 41, 9049–9061, doi:10.1093/nar/gkt555 (2013)

[6] https://www.nature.com/articles/nature09929

[7]http://www.sciencemag.org/news/2018/02/upgrade-makes-genome-editor-crispr-more-muscular-precise

[8] https://www.nature.com/articles/d41586-018-02540-x

[9]landrum, m. j. et al. clinvar: public archive of relationships among sequence

variation and human phenotype. nucleic acids res 42, d980–985,

doi:10.1093/nar/gkt1113 (2014).

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